کلونینگ و تعیین خصوصیات ژن های کد کننده ی آنزیم های اسکوالن سنتاز و 3-هیدروکسی3-متیل گلوتاریل کوآنزیم a ردوکتاز، دخیل در فرآیند بیوسنتر مایکوفنولیک اسید در قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم

مهندسی مسیرهای متابولیک شامل دستکاری عملکردهای آنزیمی و تنظیمی سلول با کمک روش های dna نوترکیب به منظور افزایش تولید ترکیبات بیوشیمیایی موردنظر می باشد. مایکوفنولیک اسید یک داروی باارزش به منظور سرکوب سامانه ی ایمنی بدن بوده و جزء ترکیبات مروترپنوئیدی است که به طور عمده توسط قارچ هایی مثل پنی سیلیوم بروی کامپکتوم تولید می شود. این ترکیب شامل یک پلی کتید متصل به مولکول فارنسیل دی فسفات (یکی از مشتقات مسیر موالونات) است. اگرچه مایکوفنولیک اسید به طور طبیعی توسط قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم تولید می شود، افزایش تولید این ترکیب با استفاده از اصول مهندسی متابولیک یکی از راهکارهای کاهش قیمت تمام شده ی محصول است. با توجه به این که فارنسیل دی فسفات پیش ساز ایزوپرنوئیدی مایکوفنولیک اسید می باشد، افزایش میزان تولید فارنسیل دی فسفات به طور منطقی افزایش تولید مایکوفنولیک اسید را به دنبال خواهد داشت. مرحله ی تعیین کننده ی سرعت واکنش و در واقع گلوگاه مسیر موالونات، مرحله ی احیاء هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم a ((hmg-coa به موالونات می باشد که توسط آنزیم hmg-coa ردوکتاز کاتالیز می شود. بنابراین بیش بیان ژن کدکننده ی این آنزیم از قارچ مورد نظر یکی از اهداف منطقی افزایش تولید مایکوفنولیک اسید می باشد. اخیراً نشان داده شده است که آنزیم های دیگری نیز درکنترل شار کربن به سمت ایزوپرنوئیدهای مختلف در این مسیر دخیل هستند. یکی از این آنزیم ها، آنزیم اسکوالن سنتاز می باشد که اولین مرحله در بیوسنتز کلسترول در پستانداران و ارگوسترول در قارچ ها را کاتالیز می کند. مطالعات بسیاری نشان داده اند که کاهش بیان ژن کدکننده ی آنزیم اسکوالن سنتاز باعث تجمع پیش سازهای لازم برای ساخت متابولیت های ثانویه ی ایزوپرنوئیدی می شود. بنابراین می توان این گونه فرض کرد که کاهش بیان ژن کدکننده ی آنزیم اسکوالن سنتاز باعث تجمع پیش سازی همچون فارنسیل دی فسفات شده و بنابراین باعث افزایش تولید مایکوفنولیک اسید شود. با این حال به علت عدم وجود توالی ژنوم این قارچ، دستکاری این ژن ها درابتدا مستلزم جداسازی ژن های کدکننده ی این دو آنزیم از ژنوم قارچ می باشد. در این تحقیق ژن های کدکننده ی دوآنزیم hmg-coa ردوکتاز واسکوالن سنتاز از قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم با روش tail-pcr همسانه سازی و تعیین توالی گردید. این روش پیمایش ژنومی بر اساس pcr، یک روش مناسب برای به دست آوردن نواحی ناشناخته در کنار یک ناحیه ی شناخته شده درون یک ژن می باشد. سپس توالی های مربوط به این دو ژن با استفاده از ابزار بیوانفورماتیک مورد تحلیل قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی dna ژنومی مربوط به ژن sqs اندازه ای معادل 2464 جفت باز داشت. این ژن دارای دو اگزون می باشد و توالی قالب خواندنی باز از نوکلئوتید شماره ی 446 تا نوکلئوتید 1937 می باشد و دم پلی a در ناحیه ی نوکلئوتید 2065 این ژن قرار دارد. همچنین توالی نوکلئوتیدی dna ژنومی مربوط به ژن hmg اندازه ا ی معادل 4304 نوکلئوتید داشت. ژن hmg دارای سه اگزون می باشد وتوالی قالب خواندنی باز این ژن از نوکلئوتید شماره ی 303 تا نوکلئوتید 3319 می باشد و دم پلی a در ناحیه ی نوکلئوتید 3332 این ژن قرار دارد. بررسی های فیلوژنتیکی نشان داد که این توالی های نوکلئوتیدی شباهت بسیار زیادی با ژن های sqs و hmg در سایر قارچ ها دارد. نتایج به دست آمده از این تحقیق راه را برای دستکاری مسیر موالونات در قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم به منظور افزایش تولید مایکوفنولیک اسید هموار می سازد.